Kinetische untersuchungen der durch die cyclodextrin-glycosyltransferase katalysierten (1→4)-α-D -glucopyrano-syltransferreaktionen, insbesondere der zyklisierungs-reaktion, mit amylosen, amylopektin und gesamtstärke als substrate - PDF Free Download (2023)

Cprbohydrate Research, 78 (1980) 147-162 @ Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam - Printed in The Netherlands

KINETISCHE UNTERSUCHUNGEN DER DURCH DIE CYCLODEXTRINGLYCOSYLTRANSFERASE KATALYSIERTEN (l-+4)-or-D-GLUCOPYRANOSYLTRANSFERREAKTIONEN, INSBESONDERE DER ZYKLISIERUNGSREAKTION, MIT AMYLOSEN, AMYLOPEKTIN UND GESAMTSTARKE ALS SUBSTRATE* HANS BENDER

Chemisches Laboratorium Deutschland)

der

Universitct,

Albertstr.

.?I, D-7800

Freiburg

i.Br.

(Bundesrepublik

(Eingegangen am 8. November 1978; angenommen in revidierter Form am 4. April 1979)

ABSTRACT

The time course of the (1+4)-e-!-D-glucopyranosyhransfer reactions catalyzed by the cyclodextrin glycosyltransferase {(l-+4)-ar-o-glucan: [(1+4)-cr-~glucopyranosylltransferase (cyclizing), EC 2.4.1.19, CGT) from Klebsiella pneumoniae was studied with several commercial amyloses, potato starch, and amylopectin, respectively_ Amyloses were poor substrates for the cyclization reaction. In the initial phase of the transfer reactions, the CGT catalyzed a rapid shortening of the amylose chains. The rate of this shortening reaction was significantly accelerated by addition of maltooligosaccharides. Maximum rate of cyclohexaamylose formation was reached with amylose chains sufficiently short (

Die ZeitabhHngigkeit der durch die Cyclodextrin-Glycosyltransferase { (l-4)or-D-glucan: [(1+4)-a-D-glucopyranosylltransferase (cyclizing), EC 2.4.1.19, CGT} von KZebsieZZapneumoniae M 5 al katalysierten Transferreaktionen wurde mit verschiedenen kauflichen Amylosen, mit Kartoffelst&ke und mit Amylopektin unterIn der sucht. Amylosen waren schlechte Substrate fiir die Zyklisierungsreaktion. *5. Mitteilung iiber Cyclodextrin-Glycosykransferase teilung, siehe Zit. 1.

von KIebsiella pneumoniae

M 5 al; 4. Mit-

148

H. BENDER

initialen Phase der Transferreaktionen katalysierte die CGT eine rapide Verkiirzung der Amyloseketten. Die Geschwindigkeit der Kettenverkiirzung wurde durch den Zusatz von Maltooligosacchariden signifikant erhaht. Cyclohexaamylose wurde mit maximaler Geschwindigkeit gebildet, nachdem die Amyloseketten auf eine fiir die Zyklisierungsreaktioo erforderliche L2nge (< Glc 100) verkiirzt waren. Mit Amylosen, die noch Verunreinigungen an Amylopektin enthielten, wurde Cyclohexaamylose in der initialen Phase der Transferreaktion mit maximaler Geschwindigkeit gebildet. Offensichtlich dienten die nicht reduzierenden Enden der gusseren Ketten des Amylopektins als Akzeptoren fiir die Disproportionierung der Amylose. Dementsprechend wurden mit Kartoffelst&ke oder Amylopektin hochmolekulare, wasserI&liche Produkte erhalten, die einen hiiheren Prozentsatz an verl3ngerten gusseren Ketten enthielten. Im Verlauf der Transferreaktionen konnten chromatographisch nur Spuren an kiirzeren Maltooligosacchariden nachgewiesen werden. EINLEKTUNG

In einer vorhergehenden Arbeit’ haben wir iiber die durch die CyclodextrinGlycosyltransferase ((1+4)-a-D-glucan: [(l-+4)-a!-D-glucopyranosyl]transferase (cyclizing), EC 2.4.1.19, CGT) von KlebsieIZa pneumoniae MS al mit (1 +4)-CL-DGlucopyranosylketten F,, 16* katalysierten Transferreaktionen berichtet. Wir konnten zeigen, daD das Enzym paraIIe1 zur Zyklisierungsreaktion eine Disproportionierung des Substrates katalysiert, die zu kiirzeren Maltooligosacchariden einerseits und zu (l-,4)-a-p-Glucopyranosylketten andererseits fiihrt, deren Lagen signifikant iiber denen des eingesetzten Substrates liegen. Aufgrund der erhaltenen Befunde konnte mit den nunmehr darangegangen werden, den Verlauf der Transferreaktionen Substraten Amylose, Amylopektin bzw. nativer Stirke eingehender zu studieren und damit die vor allem mit der CGT von Bacillus macerans durchgefiihrten zlteren Arbeiten emeut aufiugreifen. Bei diesen Untersuchungen ging es hauptsPchlich urn die mit den verschiedenen St&ken bzw. StHrkeprodukten zu erhaltenden Ausbeuten an zykIischen Transferprodukten. Es zeigte sich, da0 die Menge an Cyclodextrinen von den jeweiis verwendeten Substraten abhingen’. Die griissten Ausbeuten wurden erwartungsgemBss mit Amylosen erhalten (je nach Substratkonzentration3-5 7090%). Mit Iangkettigen Amylosen entsprachen die Ausbeuten jedoch nicht der Theorie, was u-a. damit erklgrt wurde, da0 die langkettigen Substrate im Verlauf der Inkubation durch Retrogradierung unlijslich werden’. Fiir die verzweigten Amylopektine und Glykogene wurden Ausbeuten von 40-50x an zyklischen Transferprod&ten angegebenze4. Bei entsprechend langer Inkubation von Stgrkesubstraten nahm der Gehalt an niedermoIekuIaren linearen Transferprodukten zu2, wobei jedoch nicht auszuschliessen war, daD die verwendete CGT (Bacillus macerans) noch Verunreinigungen an cc-AmyIase enthielt6. Wie Untersuchungen mit der CGT eines Stammes von *p,,,,durchschnittlicher Polymerisationsgrad.

CYCLODEXTRIN-GLYCOSYLTRANSFERASE

149

Bacillus megaterium zeigten, kann die Zunahme an Maltooligosacchariden durch Zugabe von Glucose zu einem Transferansatz mit llislicher Stsrke als Sub&at stark erhiiht werden7. Da die Ausbeuten an zyklischen Transferprodukten durch diesen Zusatz nicht wesentlich beeinflusst werden, wurde auf einen Transfer von (I -+4)-~-oGlucopyrauosylketten aus der Starke sowohl direkt auf den “Akzeptor” D-Glucose wie such iiber Cyclodextrine geschlossen. Eine charakteristische Eigenschaft der CGTs ist es, Starke- bzw. AmylopektinGele rapide zu verflilssigen 8-‘o . Diese Tatsache wurde mit einer hydrolytischen AktivitBt der Enzyme erklHrt2~10~“. French” diskutiert eine miigliche hydrolytische Eigenschaft der CGTs vorsichtig: . . .“ Alternatively a glucanosyl chain of any length can react with a suitable acceptor. If the acceptor concentration is too low for reaction, the glucanosyl-enzyme probabIy undergoes slow hydrolysis with the formation of a new reducing group . . _“. Im Gegensatz zu dem in der vorhergehenden Arbeit’ verwendeten konnen die hochmolekularen Substrate nur in wesentlich geringeren molaren Konzentrationen eingesetzt werden. Da die CGT vom nicht reduzierenden Ende einer (1+4)-1x-~Glucopyranosylkette her Cyclohexaamylose abspaltet’, sollten die Bildungsgeschwindigkeiten fiir das Cyclodextrin entsprechend geringer sein, wenn die molare katalytische Aktivitgt des Enzyms mit den langkettigen Amylosen nicht signifikant grosser ist. Mit Arnylopektinen dagegen sollte die initiate Bildungsgeschwindigkeit von Cyclohexaamylose grosser sein, da diese verzweigten a-D-Giucane eine - verglichen zum Molekiilargewicht und damit zu reduzierenden Kettenenden -grosse Anzahl an nicht reduzierenden Enden besitzen. Vor allem die Verwendung von Amylosen als Substrate bringt experimentelle Schwierigkeiten. Die in dehydratisierter Form k2ufiichen Prsparate sind aufgrund der eingetretenen Retrogradierung wasserunl6slich. Sie kijnnen zwar in Dimethylsulfoxid gel&t werden’ 3 - ls, retrogradieren jedoch bei Wasserzugabe mehr oder weniger schneil, wobei die Geschwindigkeit der Retrogradierung von verschiedenen Faktoren, z.B. Kettenlgngen, Konzentration, pH-Wert oder der Anwesenheit bestimmter Ionen abh3ngt (zu ubersicht siehe 13). Exakte Versuchsergebnisse werden dann in Frage gestellt, wenn die Retrogradierung in Verlauf der Inkubation der Transferansatze eintritt. Die meisten Amylosen enthalten noch einen gewissen Anteil an a-~-( 1+6)-glucosidischen Bindungen, sie sind demnach nicht volIst5ndig “linear” (zur Ubersicht siehe 15)_ Unbekannt ist bei kuflichen Amylosen such der Reinheitsgrad, z.B. die Mengen an verunreinigendem Amylopektin bzw. an NichtSt&rke-Komponenten l3 . Bewusst sollten fiir die geplanten Versuche kaufliche Praparate eingesetzt werden, urn maglicherweise eine Verwendung der CGT zur Reinheitsbestimmung aufzeigen zu k&nen. EXPERIMENTELLER

TEIL

Material_ - CGT wurde aus dem Kulturhltrat von Klebsiella pneumoniae M 5 al nach Vorschrift isoliert und bis zur elektrophoretischen Einheitlichkeit ge-

150 reinigtg*’ 6. Isoamylase

H. BENDER

(Amylopectin: 6-glucanohydrolase, EC 3.2.1.9) wurde aus dem Kulturfiltrat von PseunOmonas amyZoderamosa ATCC 21 262 nach dessen Konzentrierung durch Ultrafiltration (Diaflo Hollow Fiber-Patrone H 10 P IO von Amicon, Witten, BRD) nach Vorschrift gereinigt”. Das Bakterium wurde in dem angegebenen Medium’ ’ mit I,2 O? Mor Sweet 01415 (Maltose-Sirup der Maizena GmbH, Hamburg, BRD) als Kohlenstoffquelle kultiviert (Fermenterbedingungen: 200 L-Fermenter, Riihrgeschwindigkeit 150 r-p-m., Beliiftung 5000 L Luft/h, pHkonst. 6,5, Inkubationstemperatur 34”, Inkubationsdauer 30 h. p-Amylase [(I +4)-a-Dglucan : maltohydrolase, EC 3.2.1.21 aus Bataten (500 U/mg, 3 x krist., reinst) war von Serva (Heidelberg, BRD), Amyloglucosidase [(144 bzw. 6)-#-D-glucan : glucohydrolase, EC 3.2.1.31 von Boehringer (Mannheim, BRD). -41s Substrate fir die Transferansgtze dienten: Amylose 95 % rein aus Kartoffelstsrke, Mol.Gew. 150 000 (Katalog-Nr. 12470, Serva, Heidelberg, BRD): Eigene Bestimmungen egaben bei einem p”-Wert von 840 25 % ein Mol. Gew. von 136 000 &-5 % (AmS). Amylose practical grade (Katalog-Nr. 0488, Baker Chemical Co., GroB-Gerau, BRD): Eigene Bestimmungen ergaben bei .einem p,-Wert von 790 _t 5 % ein Mol.Gew. von I28 000 + 5 % (AmB). Amylose, geeignet fiir biochemische und bakterioiogische Arbeiten, aus Maisstgrke (Katalog-Nr. 2-5520, Roth KG, Karlsruhe, BRD): Eigene Bestimmungen ergaben bei einem P,,-Wert von 580 f 5 % ein Mol.Gew. von 94 000 f5% (AmR). AmyIose acs KartoffelstHrke, Praktikumsprgparat, gereinigt nach Zit. 14. Das Prgparat enthglt noch - 15 % an Amylopektin. Die Bestimmung ergab bei einem Fn-Wert von I500 t 5 % ein Mol.Gew. von 250 000 + 5 % (AmK). Kartoffelstgrke von Henkel & Cie (Diisseldorf, BRD). Amylopectin powder (Katalog-Nr. 0400 h, Koch-Light Laboratories Ltd., Colnbrook Bucks, UK). Die Maltooligosaccharid-Mischung wurde aus Transferansgtzen der CGT mit dem Substrat Cyclohexaamylose und dem Akzeptor Maltose nach gegebener Vors&rift isoliert und gereinigtl. Alle anderen verwendeten Substanzen-waren in handelsiiblicher, falls erforderlich, in reinster Form. Analytische Methoden. - Kohlenhydrate wurden mit Anthron1g*20 und rsduziereude Aldehydgruppen mit ciem Nelson-Reagens *’ bestimmt. Die Bestimmung der F,-Werte der (1+4)-a-D-Glucopyranosylketten (Amylosen) erfolgte nach GunjaSmith ef a1.“: Gesamtkohlenhydrate (als Glucose)/reduzicrende Glucoseenden. Die Bestimmung der Polymerisationsgrade langkettiger Amylosen nach dieser Methode mag mit einem grasseren Fehler behaftet sein. Sie erwies sich jedoch ftir die im Verlauf dieser Arbeit durchzufiihrenden Vergleichsmessungen als ausreichend. D-Glucose wurde enzymatisch bestimmtz3. Die Absorptionsspektren von Iodkomplexen der Substrate bzw. der Restsubstrate wurden mit einem Shimadzu Einstrahl-Spectrophotometer (Shimadzu Seisakusho Ltd. Kyoto, Japan) UV 100-02 gemessen. Zur Herstellung der Iodkomplexe wurde IO mL von 0,012 % LGsungen der cr-D-Glucane mit 0,15 mL einer 20mM LBsung von I2 in 20mM KI versetzt, die Messungen erfolgten bei 25”. Bei Amylopektin und dessen Restsubstrate wurden Iodkomplexe gemessen, die mit 0,06 mL der Iod-Iodkalium-L6sung gebiidet wurden.

CYCLODEXTRINGLYCOSYLTRANSFJZRASE

*.

151

1’: ; Papierchromatographie der Maltooligosaccharide wurde in WasserEthanol-Nitromethan (5 : 8 : 7, v/v) dreimal absteigend auf Whatman Nr. 1 bei 25 o vorgenommen. Die getrockneten Chromatogramme wurden mit der Eintauchmethode (AgNO, in Aceton, methanolische NaOH) entwickelt. Durcfzfifirung und Aufarrbeitung der Tramferansiitze. Alle TransferansHtze wurden in 1OmM Tris - HCl-Puffer, pH 7,2 (5mM an CaCl,), mit einer CGT-Konzentration von 14 mg Protein/L und bei einer Inkubationstemperatur gefiihrt. Jeweils 100 mL der Ars%ze wurden fiir einen Zeitwert

von 30” durcheingesetzt. Die

wasserunliislichen Amylosen wurden 20 %ig in Dimethylsulfoxid durch vorsichtigas Erhitzen gel&t, die erhaltenen klaren, hochviskosen LSsungen wurden mit heissem Puffer auf die gewiinschte Endkonzentration des Substrates verdiinnt. Sofort nach Abkiihlung auf 30” wurden die Transferans%ze durch Zugabe des Enzyms gestartet. Vergleichsuntersuchungen zeigten, da8 Dimethylsulfoxid in der vorgegebenen Konzentration die CGT nicht hemmt. Die nach Abkiihlung leicht triiben Amylosedispersionen erwiesen sich in Kontrollen ohne Enzym bei 30” iiber einen Zeitraum von - 1 h als stabil. Die wasserlijslichen Substrate Kartoffelstarke und Amylopektin wurden direkt in Puffer durch vorsichtiges Erhitzen gel&t. Die enzymatische Reaktion wurde nach Erreichen der gewiinschten Inkubationszeiten durch schnelle Zugabe von Methanol (1,2 Vol.) gestoppt. Das fiir die Aufarbeitung der Transferansstze ausgearbeitete Schema’ musste fir die Dimethylsulfoxidhaltigen Losungen weiter modifiziert werden, da es sich zeigte, dal3 Cyclohexaamylose und die Maltooligosaccharide in diesen AnsHtzen nicht quantitativ fraktioniert werden konnten: (a) Das im Verlauf der lnkubation retrogradierte und das mit 1,2Vol. Methanol pr%ipitierbare Material wurde nach 24 h Stehen der I%llungen (OO) durch Zentrifugation abgetrennt, dreimal nach Erhitzen in je 60 mL dest. Wasser mit Methanol (1,2 Vol.) reprazipitiert und anschliessend lyophilisiert. (6) Die vereinigten Uberstande aus (a) wurden nach Einengung im Rotationsverdampfer Iyophilisiert. Das wasserfreie Lyophilisat wurde durch zweimaliges Waschen mit reinem Aceton von Dimethylsclfoxid befreit und nach L&en in je 30 mL dest. Wasser wie beschrieben weiter fraktioniert’. Die Bestimmung der Ausbeuten an Transferprodukten und die Priifung der Zuverhissigkeit der Fraktionierung wurden in der angegebenen Weise vorgenommen’. Vor dem Abbau der Proben von miiglicherweise verzweigten Restsubstraten zur enzymatischen D-Glucosebestimmung durch Amyloglucosidase wurde mit Isoamylase vorinkubiert. Zur Bestimmung reduzierender Aldehydgruppen bzw. zur colorimetrischen Bestimmung des Gesamtkohlenhydrats mit Anthron wurden die wasserunlijslichen Restsubstrate durch Erhitzen 4%ig in Dimethylsuifoxid gel&t und anschliessend mit heissem dest. Wasser entsprechend verdiinnt. AUS solchen, zun%hst klaren Losungen wurde such eine Fraktionierung der Restsubstrate vorgenommen: Das bei langerem Stehen der LSsungen retrogradierende Materiai wurde nach 3 min Erhitzen auf 98 o durch Zentrifugation bei 50” abgetrennt.

152

H. BENDER

In gleicher Weise wurde das sich nach 24 h Stehen der 50”-Uberstande bei 4” bildende Prazipitat abzentrifugiert. Gesamtkohlenhydrat und reduzierende Aldehydgruppen wurden in allen erhaltenen Fraktionen in der beschriebenen Weise bestimmt. Zur Spaltungvon a-~-Cl +6)-glucosidischen Bindungen (Verzweigungen) wurden die Substrate bzw. Restsubstrate tit Isoamylase in 6Omhr Acetatpuffer, pH 3,6, inkubiert. Pro 500 mg Substrat wurden 20 Isoamylase-Einheiten eingesetzt. Die Entzweigung war, wie die zur Kontrolle durchgefiihrte j&Amylolyse von Proben der Ansgtze ergab, nach 20 h bei 30” vollst&dig. ERGEBNISSE

Zeitlicher Verfauf der (1+4)-u-D-Glucopyranosyltransfer-Reaktionen mit Amylose Serva (AmS) und Amylose Baker (AmB). - Eine fiisch zubereitete, Ieicht triibe

“Losung” von AmS in Puffer (Gehalt an Dimethylsulfoxid 16%) wird nach Zugabe von CGT triiber und ziihfliissig. Diese im Verlauf der Inkubation fortschreitende Verdickung der Transferansgtze macht es unmiiglich, mit BGheren Substratkonzentrationen als 2,5% zu arbeiten. Die Zyklisierung zu Cyclohexaamylose zeigt bei dieser

Anfangskonzentration des Substrates (-0,lSmM) eine relativ lange Anlaufphase, maximale Geschwindigkeit der Zyklisierungsreaktion wird erst nach 8,5 min Inkubation erreicht (Am&, Abb. 1, Kurve 1); u,,, SetrQt 0,6 kat - kg-l Protein. Fiir vi in der ersten Minute der Inkubation ist dagegen ein Wert von nur 0,036 kat kg-’ Protein zu bestimmen. Nach 5 h Inkubation ist mit 13,4mM die maximale

Menge an Cyclohexaamylose erreicht. Vollkommen anders verlauft die zeitabhgngige Zunahme an Cyclohexaamylose, wenn dem Transferansatz bei der Anfangskonzentration des Substrates AmS von -0,16mM Maltooligosaccharide (P, 8,4) in einer Konzentration von 2,8mM zugefiigt werden (Am&, Abb. 1, Kurve 2). Nach nur kurzer Anlaufphase ist die maximale Bildungsgeschwindigkeit des Cyclodextrins erreicht (v,,, 1,8 kat - kg-’ Protein).

20

40 mi n (309

Abb. 1. Bildungsgeschwindigkeit von Cyclohexaamylose und zeitabh&giger Substratumsatz mit und Amylose Serva + Maltooligosaccharide (Art&) im Verlauf 60 min

Amylose Serva (An&)

Inkubation (30’). Anfangskonzentration des Substrates AIT& 2,5%, An& 2,2”/, + 2,8m~ Maltooligosaccharide A 8,4, 14 mg CGT/L. Fiir die Aufarbeitung siehe Ekperimenteller Teil bzw. Zit. l_

Kurven 1 und 2: VerIauf der Zunahme an Cyclohexaamylose Substratumsatz mit Am% bzw. Am&.

bei Am% bzw. Am&. Kurven 3 und 4:

153

-600

Abb. 2. Zeitabhtigige Abnahme der %Werte der Restsubstrate und Anderung der AbsorpGonsmaxima ihrer Iodkomplexe im Verlauf der Inkubation mit Am& bzw. AmSe. Fiir die Aufarbeitung der Restsubstrate, die Bestimmung ihrer &-Werte und die Herstellung der Iodkomplexe siehe Experimenteller Teil. Kurven 1 und 2: P,-Werte der Restsubstrate bei An& und Am&. Kurven 3 und 4: Absorptionsmaxima der Restsubstrat-Iodkomplexe bei Am& und Am&.

Maximal ist nach 60 min Inkubation eine Konzentration an Cyclohexaamylose vcn 13,6mhi zu bestimmen. Entsprechend der griisseren Bildungsgeschwindigkeit von Cyclohexaamylose nimmt die Menge an offensichtlich nicht umgesetztem Substrat bei Am& schneller ab als bei AmS, (Abb. 1, Kurven 3 und 4). Wie die Analyse ergibt, sinken die P,-Werte der aus den Zeitproben zuriickgewonnenen Restsubstrate im Verlauf der Inkubation, vor allem in der initialen Phase der Transferreaktion, wobei die Geschwindigkeit der Kettenverkiirzung bei AmS, signifikant griisser ist (Abb. 2, Kurven 1 und 2). Die zeitabhgngige Abnahme der Kettenlgngen bewirkt eine Verschiebung der Absorptionsmaxima der mit den Restsubstraten erhaltenen IodkompleFe in den kiirzerwelligen Bereich des Spektrums (Abb. 2, Kurven 3 und4)*. Die Geschwindigkeit der Kettenverkiirzung ist sowohl bei AmS, wie such bei AmS, weit griisser, als es einer Abnahme der F,,-Werte ausschliesslich durch Zyklisierungsreaktionen entsprechen wiirde. Trotz der Verschiebung der Absorptionsmaxima der Iodkomplexe kijnnte eine Abnahme der durchschnittlichen Kettenlgngen zum Teil wenigstens durch eine Mischung von nicht umgesetztem Substrat und wesentlich kiirzeren (I +4)-a-D-Glucopyranosylketten vorgetsuscht werden. Eine Fraktionierung des aus den Zeitproben zuriickgewonnenen Restsubstrats zeigt, daO dies nicht der Fall ist: Bei AmS, nehmen die Gesamtmengen der bei 50” unliislichen Amylosefraktion sowie deren p,-Werte im Verlauf der Inkubation stetig ab. Das bei 4” unliisliche Material nimmt im Verlauf 20 min Inkubation zu, seine Menge bleibt aber dann annshemd konstant, die P,-Werte sinken von 120 auf 90 und verringem sich erst in der spgteren Phase der Transferreaktionen (Abb. 3, Kurven 1 und 2). von (l-+4)-CC-D-Gluco*Die meisten Angaben iiber den Zusamm enhang zwischen den mgen pyranosylketten und den Absorptionsmaxima ihrer Iodkomplexe sind miteinander nicht vergleichbar, da die Lage der Maxima vor allem durch die Konzentration an Kaliumiodid beeiiusst wird”4. Die

in dieser Arbeit erhaltenen Werte, die unter gleichen Bedingungen erhalten wurden, sind jedoch miteinander vergIeichbar2sn*s.

H. BENDER

Abb. 3. Fraktionierung der Restsubstrate aus Am% und Am&. Fiir die Fraktionieruny siehe Experimenteller Teil bzw. Zit. 1. Kurven 1 und 3: bei 50” unlbsliche Anteile der Restsubstrate aus Am& bzw. Am&. Kurven 2 und 4: Bei 4” unl6sliche Anteile der Restsubstrate aus Am% bzw. Am&. Kurve 5: Im 4”-ubestand nachweisbare (144)~a-D-Glucopyranosylketten aus Am!%. Die Zahlen iiber den Messpunkten geben die ermittelten &-Werte an.

Bei AmS, nehmen die Mengen an dem bei 50”- und dem bei 4”-unliislichen Material unter

signifikanter

Kettenverkiirzung

in der

initialen

Phase

der

Transferreaktion

zuniichst zu. Die F,.,-Werte pegeln sich bei der 50°-unliislichen Amylosefraktion auf 95-100, bei der 4”-unleslichen auf -60 ein (Abb. 3, Kurven 3 und 4). WHhrend in den 490berstgnden von AmS, kiirzere (1+4)-a-D-Glucopyranosylketten nicht nachznweisen sind, k&men in den uberstgnden von AmS, in den zu spgteren Zeitpunkten gezogenen Proben kleine Mengen an Ketten mit durchschnittlichen LHngen urn 26 bestimmt werden (Abb. 3, Kurve 5). Mit AmB erhielten wir gleiche Resultate wie mit AmS. Es kann deshalb darauf verzichtet werden, ntier auf diese Versuchsserie einzugehen.

ZeitZicher Vedauf der (I+4)-a-D-Ghcopyranosyltransferreaktionen mit Amylose Roth (AmR) und Amylose aus Kartofilstiirke (AmK). - Bei einer Anfangskonzentra-

tion des Substrates AmR von I,8 % (-0,195mM) ist fiir die initiale Bildungsgeschwindigkeit von Cyciohexaamylose ein Wert von 4,8 kat - kg-l Protein zu bestimmen (Abb. 4, Kurve 1). Im Gegensatz zu den Ansgtzen mit AmS und AmB sinken die Fn-Werte des entsprechend der Bildung von Cyclohexaamylose abnehmenden Substrates (Abb. 4, Kurve 2) nur geringfiigig und nehmen im Verlauf der weiteren Inkubation zn. Die Fraktionierung der aus den Zeitproben znriickgewonnenen Restsubstrate ergibt, da5 deren liislicher Anteil im Verlauf 40 min Inkubation stetig zunimmt (Tab. I). Die Wasserlijslichkeit der aus der spgteren Phase der Transferreaktion zuriickgewonnenen Restsubstrate, ihre zu ermittelnden F,-Werte und die Absorptionsmaxima ibrer Iodkomplexe stimmen fir Amylosen nicht iiberein und unterscheiden sich grundsHtAich von den fiir AmS und AmB erhaltenen Daten. Es lag der Schluss nahe, da13AmR durch grijssere Mengen an Amylopektin verunreinigt

155

CYCLODEXTRIN-GLYCOSYLTRANSFERASE

LO min (30’)

20

Abb. 4. Bildungsgeschwindigkeit von Cyclohexaamylose und zeitabhlngiger Substratumsatz mit Amylose Roth (AmR) und Amylose aus Kartoffelstiirke (AmK) im Verlauf von 60 min Inkubation (30”). Anfangskonzentration der Substrate l,S% (AmR) und 3% (AmK), 14 mg CTG/L. Fur die Aufarbeitung siehe Experimenteller Teil bzw. Zit. 1. Kurven 1 und 3: Verlauf der Zunahme an Cyclohexaamylose mit AmR bzw. AmK. Kurven 2 und 4: Substratumsatz mit AmR bzw. AmK.

TABELLE

I AmR

ZU~ABHXNGIGER SUBSIXATU~ISATZ ZURiiCKGEW0NNENENRE.STSIJBSTRA-I.E~

m-r

Inkubationszeit (min)

Restsubstrat

/3-Amyiolyse

(md

(%P

0 (Kontr.) 1 3

10 20 40

b

1830[580] 123015751 930[550]

620[595] 46016401 (587) 370[740] (585)

UND

CHARAK~ERISIERUNG

DER

AUS

DEN

ZEITPROBEN

Fraktionierr vg, bei 50 o uad 4 o LWich

(my)

UnlWich b (mg)

71 62 57

3W617) 467(602) 428(605)

39

329(604)

502(578)[600] 291(576)

34 31,3

313(594) 315(593) 17601

147 55 +

Enfzweigtmgb~d

1446(607) 763(595)

--, [99](597)

P4](594)

OFiir die Fraktionierung der Restsubstrate und die Herstelhmg ihrer Iodkomplexe siehe Experimenteller Teil. % eckigen Klammem ermittelte Pn-Werte; in runden Klammem, Absorptionsmaxima der Iodkomplexe (nm). ~Zur ~Amylolyse wurden 20 mg Substrat mit 10 pg p-Amy&e in 50 mL

60mM Citratpuffer, pH 6,2, bei 30’ solange inkubiert, bis k&e Zunahme an reduzierendenAldehydgruppen mehr festzustellen war. Der Prozentsatz der /?-Amylolyse errechnet sich aus den pro mg Substrat gebildeten Mengen an Maltose. dZur Entzweigung wurden die aus den Restsubstmten erhaltenen Fraktionen 20 h bei 30” inkubiert.

(500 mg) mit 20 Isoamylase-Einheiten

in 100 mL 6OmM Acetatpuffer,

pH 3,6,

ist. Neben der Viskositltsbestimmung ist der Grad der &Amylolyse ein wichtiges Kriterium zur Charakterisierung einer Amylose (70-90x /3-Amylolyse fiir ver-

schiedene reine Amylosen’2*15 ). Im Gegensatz zu AmS (8648% AmR nur zu 71% durch j?-Amylase abgebaut. Der Grad den Zeitproben der Transferansiitze zuriickgewonnenen sich stetig (Tab. I). Die bei 50”~unlosliche Fraktion des zuriickgewonnenen sowie der lijsliche Anteil des nach 40

j?-Amylolyse) wird

der &Amylolyse des aus Restsubstrates verringert nach 3 min Inkubation min Inkubation zuriick-

156

H. BENDER

,gewonnenen

Restsubstrates

wurden

mit Isoamylase inkubiert

(Tab.

I). Die Bestim-

mung der F,,-Werte nach der Entzweigung ergibt, daB die unliisliche Fraktion pro Molekiil6, die liisliche Fraktion pro Molekiil 14 a-~-(1 +6)-glucosidische Bindungen enthllt*. Es war zu erwarten, daB die Transferrealction mit AmK wie mit AmR verlluft, da wir wissen, da13 AmK konzentration

noch etwa 15 % an Amylopektin

dieses Substrates

von 3 % (*

0,12mM) [emailprotected]

enthgt.

Bei einer Anfangs-

ui fiir Cyclohexaamylose

4,2 kat - kg-l Protein (Abb. 4, Kurve 3). Die p”-Werte des aus den Zeitproben zuriickgewonnenen Restsubstrates (Abb. 4, Kurve 4) steigen im Verlauf 40 rnin Inkubation auf iiber 3000 an, die Absorptionsmaxima der Iodkomplexe verschieben sich von 630 nm (KontrolIe) in den kiirzerwelligen Bereich des Spektrums urn 570 nm. ZeitIicher

Verlauf der (I +4)-a-D-Ghcopyranosyltransfer-Reaktionen

mit Kar-

Wie einleitend erwtint, werden die viskosen L6sungen beider Polymere (“Gele”) durch die CGT sehr rasch verfliissigts~g. Diese Verfliissigung, die mit einer hydrolytischen Aktivittt des Enzyms in Zusammenhang ist bei 3,5%igen Liisungen unter den van uns angewandten Begebracht wurde”, dingungen nach etwa 70 s Inkubation erreicht. toflehtiirke und Amylopektin.

-

Die Konstante ui fiir Cyclohexaamylose ist mit Kartoffelstsrke z;12,7 kat . kg-l Protein zu bestimmen, die maximale Konzentration an dem Cyclodextrin ist nach 60 min Inkubation mit 13,2mM erreicht (Abb. 5A, Kurve 1). Nach 40 min Inkubation sind noch 62% des eingesetzten an Restsubstrat nachzuweisen (Abb. 5, Kurve 2).

550

610nm

Abb. 5. Bildungsgeschwindigkeit von Cyclohexaamylose und zeitabhtigiger Substratumsatz mit Kartoffelstlrke und Amylopektin im Verlauf van 40 min Inkubation (309. Anfangskonzentration der Substrate 3,5%, 14 mg CGT/L. Fiir die Aufarbeitung siebe Fxperimenteller Teil bzw. Zit. 1. A, Kurven 1 und 3: VerIauf der Zunabme an Cycloh exaamylose mit Kartoffelst&ke bzw. Amylopektin, Kurven 2 und 4: Substratumsatz mit Kartoffelst&ke bzw. Amylopektin. B, Absorptionsspektren der Iodkomplexe: (1) KartoffelstBrke (Kontrolle), (2) Kartoffelsttike (Restsubstrat nach 20 min Inkubation), (3) Arnylopektin (Kontrolle), (4) Amylopektin (Restsubstrat nach 3 min Inkubation).

*Auch bei AmS verringert sich der Grad der B-Amylolyse im Verlauf der Inkubation gcringfiigig:

Die aus der Zeitprobe T.SO &II zuriickgewonnene Restamylose wird nurmchr zu 80% durch &Amylase abgebaut. Wiihrend in AmS selbst eine Spahung von a-D-(l-6)-glucosidischen Bindungen durch

exakt nicht nacbzuweisen ist, Itit sich in dem nach 60 min Inkubation erhaltenen Restsubstrat pro Molekiil 1 a-D-(1-+6)-glucosidische Bindung bestimmen. Isoamylase

157

CYCLODEXTRIN-GLYCOSYLTRANSFERASE TABELLE

II

ZElTABHjiNGIGER ZEITPROBEN

Inkubationszeit (min)

0 (Kontr.) 192 3 10

SUBSTRA TUh3SA-E

ZURtiCKGEWONNENEN

Restsubstrat” (mg.J

3500(626)= 3200(597) 2900(592) 2450(581)

20

2300(562)

40

2240(56 1)

MIT

KARTOFFELST~RKE

UND

CHARAKTERLSIERUNG

DER

AUS

DEN

RESTSUBSTRATE”

Fraktionierung, bei 50 D unci 4 o

Entzweigung, bei 4O b.e

UnhisIt-ch

LGslich

Uttliislich

(md

(mgl”

Owl

200

2250(582) [-6500] 2280(564) [-65OOJ

23

--, +

1570(598) 146l li’OO(586) 137341

Liislich tmgl

680 Ell,Sl 580 C9,Sl

=Fiir die Fraktionierung

der Restsubstrate und die Herstellung ihrer Iodkomplexe siehe Experimenteller Teil. bZur Entzweiguttg wurden die aus den Restsubstraten erhaltenen, bei 50”- und 4”-Mslichen Fraktionen (500 mg) mit 20 Isoamylase-Einheiten in 100 mL 6Omhf Acetatpuffer, pH 3.6, 20 h bei 30” inkubiert. ‘In runden Klammem, Absorptionsmaxima der Iodkomplexe: in eckigen Klammern, ermittelte &-Werte.

Bis zu 10 min Inkubation steigen die Reduktionswerte der aus den Zeitproben zuriickgewonnenen Restsubstrate leicht an, bei den zu spHteren Zeitpunkten der Inkubation zuriickgewonnenen Restsubstrate sind keine reduzierenden Aldehydgruppen mehr zu bestimmen. Die Absorptionsmaxima der Iodkomplexe verschieben sich mit zunehmender Inkubationsdauer in den kiirzerwelligen Bereich des Spektrums (Tab. II), wobei die Absorptionspeaks flacher werden (Abb. 5B, Kurven 1 und 2). Es war anzunehmen, dal3 es sich bei den aus den spateren Zeitproben zuriickgewonnenen Restsubstrate urn Amylopektin handelt. Die nach 10 min bzw. nach 20 min Inkubation erhaltenen Restsubstrate wurden durch Isoamylase entzweigt (Tab. II). Nach der Entzweigung erbalt man den griissten Teil der Restsubstrate als bei 4“ unliisliche (l-+4)-cr-D-Glucopyranosylketten mit P,-Werten von 46 (t,,-, min Restsubstrat) bzw. 37,4 (f2e minRestsubstrat). Bei einer Anfangskonzentration von 3,5x Amylopektin betragt ui fur Cyclohexaamylose 2,1 kat - kg-’ Protein, die maximale Konzentration an dem zyklischen Transferprodukt ist nach 40 min Inkubation mit 11,2mM erreicht (Abb. 5A, Kurve 3). Nach dieser Inkubationszeit sind noch 64% des eingesetzten an Restsubstrat zu bestimmen (Abb. 5A, Kurve 4). Reduzierende Aldehydgruppen sind in keinem der aus den Zeitproben zuriickgewonnenen Restsubstrate nachzuweisen. Die Absorptionsmaxima ihrer Iodkomplexe verschieben sich geringftiglg in den 18ngerwelligen Bereich des Spektrums. Gleichzeitig vergrossern sich Iodbindungskapazitit und damit die Extinktionswerte (Tab. III und Abb. 5B, Kurven 3 und 4). Nach der Entzweigung des aus den Zeitproben t70s und fZOminzuriickgewonnenen Restsubstrates bzw. einer Amylopektin-Kontrolle mit Isoamylase e&tilt man das folgende Verteilungsmuster der linearen ([emailprotected] (Tab. III): Der Prozentsatz

158 TABELLE

H. BENDER III

ZElTABH&GIGER

S UBSlXATUMSATZ

PROBEN ZURi_iCKGEWONNEN!%

MIT AhlYLOPEKlTN

UND

CHARAKl-ERISIERUNG

DER AUS DEN ZEiT-

RESTSUBSlRATE -

Znkubationszeit (min)

Restsubstrat

Extinktion

(mg) b

Entzweigung, Methanol-Fraktionierunp

In 60% Methanol Unbislich Bei 4”

0 (Kontr.) 122 3 10 20 40

3500(532) 2850(547) 2700(551) 2460(553) 2360(553) 2300(553)

0,28 0,66 0,71 0,82 0,87 0,89

Liislich (mg)’

Unl&lich

Lklich

(mgl c

(mgP

700[37,5] 627[40,3]

1880[18,2] 3112[213

566[411

567[21,6J

920[13,41 1111[10,2] 1227[9,5]

~Zur Entzweigung wurden die Restsubstrate (500 mg) mit 20 Isoamylase-Einbeiten in 100 mL 6OmM Acetatpuffer, pH 3,6, 20 h bei 30% inkubiert. Die in 60% Methanol unliislichen Anteile des entzweigten Materials wurden durch Zentrifugation abgetrennt und in Wasser gel&t. Aus der w%srigen Lasung wurde das bei 4” unl&liche Material abzentrifugiert. bin runden Klammem, Absorptionsmaxima der IodkompIexe (run). Filr die HersteIIun~ der Iodkomplexe siehe Experimenteller Tei!. CIn eckigen Klammem, ermittelte &Werte.

an kiirzeren

Ketten

nimmt

mit der Inkubationsdauer

zu. Ebenso

vergriissert

sich im

Vergleich zur Kontrolle der Anteil an hingeren (144)-or-D-Glucopyranosylketten. Bildung van Maltooligosacchariden im Veriauf der von der CGT mit den hochmolekularen Substraten katalysierten (I+4)-a-D-Glucopyranosy/transfer-Reaktionen. - Nach den mit der Versuchsserie AmS, erhaltenen Ergebnissen sollten in den Transferansatzen reduzierende kleinere Transferprodukte, die theoretisch nach Gleichungen’ (I) und (2) entstehen kiinnten, zumindest in der Anfangsphase der Transferreaktionen nicht nachzuweisen sein. Das in den Zeitproben der Ans%ze AmS, und AmS, nach Abtrennung der Restsubstrate bzw. der Cyclohexaamylose zu bestimmende Anthron-positive Material besteht zu 64% aus einem durch fraktionierte Acetonfallung abzutrennenden Kohlenhydrat, fiir das P”-Werte >60 zu ermitteln sind. Da dieses Material keinerlei “Iodfarbe” zeigt (es enthtit keine zyklischen Transferprodukte) und offensichtlich kein Substrat ftir j&Amylase bzw. fiir Amyloglucosidase ist, kann angenommen werden, da13 es sich dabei urn eine Nicht-Stilrke-Veruninigung des Amylose-Przparats handelt. Fiir das verbleibende Anthron-positive Material der Uberstande ist in allen Fallen ein Pm-Wet-t van 13 zu ermitteln. Unter Zugrundelegung dieser durchschnittlichen Kettenlangen nimmt die Konzentration an dieser Saccharidfraktion bei AmS, von 0,04m~ nach 1 min Inkubation im Verlauf von 20 min Inkubation auf 0,28mM zu und bleibt dann ann5hemd konstant. Bei An& ist nach 1 min Inkubation eine Konzentration von

159

CYCLODEXTRIN-GLYCOSYLTRANSFERASE

0,44mM zu bestimmen.

Bei dieser Saccharidfraktion

handelt

es sich, wie das Chro-

matogramm zeigt, noch weitgehend urn Reste der vorgelegten Maltooligosaccharide. Im Verlauf der Inkubation sinkt die Konzentration auf einen annHhernd konstant bleibenden Wert von 0,29mM ab. Chromatographisch lassen sich neben hijheren Sacchariden Spuren an Zuckern nachweisen, die sich wie D-Glucose bzw. wie Homo-

loge der Maltosaccharidreihe erhaltenen

Glc, bis Glc, verhalten. Die mit den anderen Substraten

Befunde entsprechen

nicht weiter eingegangen

den fur AmS mitgeteilten,

so daD im einzelnen

darauf

zu werden braucht.

DISKUSSION

Unsere

Versuche

zeigen,

dal3 die annlhemd

reinen Amylosen

AmS

und AmB

hinsichtlich der Zyklisierung zu Cyclohexaamylose relativ schlechte Substrate fiir die CGT von K. pneumoniae M 5 al sind. Erst qach einer prim& erfolgenden Verkiirzung der Amyloseketten, die durch Zugabe von Maltooligosacchariden signifikant beschleunigt wird, verlzuft die Zyklisierungsreaktion mit maximaler Geschwindigkeit*. Es ist naheliegend, amylose

eine Abhangigkeit

von der Anzahl

der Bildungsgeschwindigkeit

der vorliegenden

nicht

reduzierenden

von CyclohexaKettenenden

anzu-

nehmen. Deren Gesamtmenge erhiiht sich (entsprechend der ErhShung der molaren Konzentration des Restsubstrates) in der initialen Phase der Transferreaktion aufgrund der festzustellenden Kettenverkiirzung. Aus der graphischen Darstellung von ergibt sich jedoch keine lineare Abl/(S) gegen l/u nach Lineweaver und Burk” h%igigkeit der Bildungsgeschwindigkeit von Cyclohexaamylose von der Substratkonzentration (Masszahl fiir die nicht reduzierenden Kettenenden bei linearen Substraten). Eine Gerade erh3lt man jedoch bei der graphischen Darstellung von l/u gegen l/(S’), wobei (s’) der Konzentration an den aus den Zeitproben von AmS, bis 15 min Inkubation bzw. AmS, nach 1 min Inkubation erhaltenen, bei 50” I&lichen, aber bei 4” unliislichen Anteile der Restsubstrate entspricht (Abb. 6). Demnach scheinen fiir die Zyklisierungsreaktion offensichtlich Ketten

sich fiir (l-,4)-a-D-Glucopyranosylketten

P,., -70

fiir V ein Wert von 2 kat -

*Die im Verlauf der Inkubation einsetzende Triibung und Verdickung der Transferansltze mit AmS und AmB ist demnach eine FoIge der einsetzenden Kettenverklhzung (zur Ubersicht siehe Zit. 13,15). Da wir nicht wissen, ob vor aIlem in der splteren Phase der Transferreaktionen die fur die Umsetzungen effektive (lijsliche) Substratkonzentration der insgesamt bestimmbaren entspricht, sol1 darauf verzlchtet werden, auf Gleichgewichtslagen zwischen linearen und zyklischen Transferprodukten sowie auf die Ausbeuten an Cyciohexaamylose in Abhangigkeit von der Substratkonzentration ausfilicher einzugehen.

160

H. BENDER

Abb. 6. Bildungsgeschwindigkeit van Cyclohexaamylose in Abhkgigkeit der Komentration an 50” Iiislichem, 4” unliislichem Material der Restsubstrate (9). Darstellung von l/v gegen l&S’) nach Zit. 27. Filr die Berechnung liegen die bei Am!% bis 15 min bzw. bei Am& nach 1 min Inkubation ermittelten Werte zugrunde. Fiir die Fraktionierung der Restsubstrate siehe Experimenteller Teil.

Protein. Da mit (1+4)-a-D-Glucopyranosylketten pm 16 fiir V 6,2 kat - kg-’ Protein ermitteit wurden’, scheint die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (bezogen auf die Anzahl der nicht reduzierenden Kettenenden) mit den beiden Substraten nicht wesentlich zu differieren. Die rapide Verkiirzung der Amyloseketten in den Transferans%zen Am& ist durch Disproportionierungsreaktionenl (2) zwischen den Amyloseketten und den Maltooligosacchariden gut erlcllrbar, wobei entsprechend (I) die Maltooligosaccharide allerdings mit grosser der “Kupplungsreaktion”’ Effektivitgt als “Akzeptoren” langer Kettenreste fungieren miissen: Die Fraktionierung der Restsubstrate zeigt, da13 in der initialen Phase der Transferreaktion der Gehalt an Amyloseketten mit p,,-Werten von 70 sprunghaft ansteigt, wghrend zum gleichen Zeitpunkt von den vorgelegten Maltooligosacchariden nur noch Spuren nacbzuweisen sind. Eine Erklgrung fiir die Kettenverkiirzung in den Ansstzen AmS, muss im Augenblick spekulativ bleiben. Die Disproportionierung des hochmolekularen Substrates selbst kann ausgeschlossen werden, da such nach Fraktionierung der Restsubstrate keine signifikant lgngeren Amyloseketten ermittelt werden kiSnnen und die Kettenverkiirzung schneller erfolgt, als sie durch Disproportionierung bzw. aufgrund van ZyIcIisierungsreaktionen e&l&bar wgre. Geht man davon aus, daB das Amyloseprgparat keine als “Akzeptoren” dienende Saccharide enthXlilt (such eine Fraktionierung von AmS liefert keine Hinweise auf das Vorhandensein einer solchen Verunreinigung), so bleiben zwei Mijglichkeiten fiir die Erklgrung: (a) Bei einem Gleichgewicht zwischen der zyklischen und der linearen Form eines Enzym-gebundenen Maltohexaosylrestes kSnnte dieser in linearer Form als “Akzeptor” fiir die Disproportionierungsreaktion dienen. (Amylosen sind polydispers, d-h. such AmS wird kiirzere Ketten enthalten, die fiir Zyklisierungsreaktionen gee&net sind; in der Tat lassen sich such in der initialen Phase der Transferreaktion mit AmS, geringe Mengen an Cyclohexaamylose bestimmen). (‘0) Wie friiher bereits vermutet2~‘0-1z, besitzt die CGT hydrolytische Aktivitit. Wir werden diese Frage noch eingehender zu priifen haben. kg-l

161

CYCLODEXTRIN-GLYCOSSFERASE

Fiir das hinsichtlich des Verlaufs der Zyklisierungsreaktion vijIlig andere Verhalten mit den Substraten AmR und AmK kijnnen die im Vergleich zu AmS unterschiedlichen P,-Werte nicht als Erklgrung dienen. Alle erhaltenen Befunde lassen keinen anderen Schluss zu, als da13 die nicht reduzierenden Kettenenden diesen Amyloseptiparaten nachzuweisenden Amylopektin-Verunreinigungen “Akzeptoren”

fiir die Disproportionierung

nach

Gleichung’

(2) fungieren,

der in als urn die

fiir die Zyklisierung erforderlichen Kettenlgngen (sowohl verkiirzte Amyloseketten wie such die entsprechend verltingerten gusseren Ketten des Amylopektins) bereitzustellen. Diese Annahme wird durch die mit Kartoffelstlrke und Amylopektin erhaltenen Ergebnisse erhgrtet: Alle bisher untersuchten Amylopektine enthalten nach Entzweigung eine kleinere Population an l&ngeren linearen (l-+4)-a-D-Glucopyranosylketten, z.B. Maniok-Stirke etwa 13 % der gesamten linearen Ketten (unit chains) mit einem i?n-Wert35*3 6 von 45. Bei dem aus unseren Transferansgtzen mit KartoffelstHrke zu isolierenden wasserlSslichen Restsubstrat kann es sich demnach nicht urn natives Amylopektin handeln. Unter der berechtigten Annahme, dal3 das Material keine Amyloseketten mehr entINt, kann geschlossen werden, da13 es sich urn ein Amylopektin handelt, dessen zussere Ketten durch Transferreaktionen aus Amylose verlBngert wurden*. Es w5re damit miiglich, mit Hilfe der CGT aus StHrke mit etwa 60 % Ausbeute ein quasi weniger hoch verzweigtes Amylopektin herzustellen. Mit der rapiden Abnahme des Amylose-Anteils und der Iinderung der Molekiilstruktur von Amylopektin kann die schnelle Verfliissigung eines Stsrkegels e&l&t werden. Auch die Ergebnisse der mit Amylopektin durchgefihrten Transferansztze sprechen dafiir, dal3 die CGT parallel zur Zyklisierung einen Transfer linearer Teilstiicke zwischen den Ketten des Amylopektins katalysiert. Wie bei der Gesamtstzrke mag diese Umstrukturierung Ursache fiir die Verfliissigung eines Amylopektingels sein. Bei allen, mit den hochmolckularen Substraten durchgefiihrten TransferansN.zen sind such nach mehrstiindiger Inkubation hachstens Spuren an reduzierenden, niedermolekularen Transferprodukten nachzuweisen. Dieses Ergebnis deckt sich mit der in der vorhergehenden an Maltooligosacchariden

Arbeit’ gemachten Feststellung, daB die Gesamtmenge mit zunckmender Kettenlinge des Substrates abnimmt.

DANK

Die hier durchgefiihrten Untersuchungen unterstiitzt (Be 789/l).

wurden

mit Mitteln

der Deutschen

Forschungsgemeinschaft

*Uber die Transferreaktionen der CGT mit verzweigten a-D-Glucanen soil an anderer Stelle ausftilicher berichtet werden. Es werden deshalb nur naten angegeben, die fir das Verstzndnis der dieser Arbeit zugrunde liegenden Fragestellung von Eedeutung sind. Es sollte erwmt werden, dal3 die nach der Entzweigung zu ermittelnden i%-Werte der linearen (1+4)-a-D-Glucopyranosylketten rnit grikster Wahrscheinlichkeit nicht durch “D-Glucose-Stubs”, die von der Isoamylase nicht abgespalten werden k&men, verf%cht werden.

162

H. BEND&

LITEXATUR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

BENDER, Curbohydr. Res., 78 (1980) 133-145. FRENCH, Adv. Curbohydr. Chem., 12 (1957) 189-260. W. KERR, J. Am. Chem. Sot.. 65 (1943) 188-193. J. W~SON, JR., T. J. SCHOCH UND C. S. HUDSON, J. Am. Chem. Sot., 65 (1943) 1380-1383. CRAMMER UND D. S-IEINL& Justus Liebigs Ann. Chem., 595 (1955) 81-100. J. A. DEPINTO UND L. L. CAhn=Brxt-, Arch. Biochem. Biophys., 125 (1968) 253-258. S. JGT~TA UND S. OKADA, Agric. Biol. Chem., 39 (1975) 2185-2191. A. G. LANE IJND S. J. PIRT, J. Appl. Chem. Biotechnol., 21 (1971) 330-334. H. BENDER, Arch. Microbial., 111 (1977) 271-281. S. KOBAYASHI, K. KAINUMA uhm S. SUZUKI, Carbohydr. Res., 61 (1978) 229-238. 3. A. THOhfA UND L. STEWART, in R. L. W-ER UND E. F. PAXFXALL (Eds.), Srarch: Chemistry and Technology, Vol. 1, Academic Press, New York, 1965, ss. 209-249. D. FRENCH, M-T-P. Int. Rev. Sci. Org. Chem. Ser. Five, Carbohydr., (1975) 267-235. J. F. FOSIER, in R. L. WHJXLER UND E. F. PASCHALL (Eds.), Starch: Chemistry and Technology, Vol. 1, Academic Press, New York, 1965, ss. 349-391. G. K. ADKINS UND C. T. GREENWOOD, Curbohydr. Res., 11 (1969) 217-224. C. T. GREENWOOD, in W. PrcihfAN UND D. HORTON (Eds.), The Carbohydrates: Chemistry and Biochemistry, Vol. lIB, Academic Press, New York, 1970, ss. 471-513. H. BENDER, Arch. Microbial., 113 (1977) 49-56. K. YOKOBAYASHI, A. &AIU END T. HARAD A, Biochim. Eiophys. Acta, 212 (1970) 458469. T. HARADA, K. YOKOBAYASHI UND A. MBAICI, Appt. Microbial., 16 (1968) 1439-1444. R. G. SPIRO, Methodr Enzymol., 8 (1966) 3-3cjF. J. Vnss UND L. sK.VERMAN, Anal. Chem., 21 (1949) 950-953. N. NELSON, J. Bioi. Chem., 153 (1949) 375-380. Z. GUNJA-SMITH, J. J. MARSHALL UND E. E. Shfrr~, FEBS Lett., 13 (1971) 309-311. A. -ON, Abstr. Pap. Am. Chem. Sot. Meet., 129 (1956) 31C. S. ONO,S.?sU ~XBHASHI m-m T. KUGE, J. Am. Chem. Sot., 75 (1953) 3601-3602. R. R. BALDWIN, R. S. BEAR mm R. R~NDLE, J. Am. Chem. Sot., 66 (1944) 111-115. B. PFA~M~LLER, Carbohydr. Res., 61 (1978) 41-52. H. LINEWF.AVER mm D. BURK, J. Am. Chem. Sot., 56 (1934) 658-666. K. MYRBACK UND L. G. GJGRLING, Ark. Kern. Mineral. Geol., Ser. A, 20 (1945) l-13. C. F. CORI, Fed. Proc., Fed. Am. Sot. Exp. Bioi., 4 (1945) 226. M. B. SENIOR UND E. HAMORI, Biopolymers, 12 (1973) 65-78. J. SZEJTLI END S. AUGUSTAT, Staerke, 18 (1966) 3842. W. BAMC~ END C. T. GREENWOOD, Carbohydr- Res., 7 (1968) 349-356. Q_ T. NGWEN, P. APTEL UND J. NEEL, Biopolymers, 15 (1976) 2097-2100. B. PFANNEMELLER, H. MA~ERHOFER UND R. C. SCHULZ, BiopoZymers, 10 (1971) 243-261. L. F. HOOD, Curbohydr. Res., 61 (1978) 53-66. Z. GUNJA-SMITH, J. J. MARSHALL, C. MERCIER, E. E. SMI~ UND W. J. WHELAN, FEBS Lat., 12 (1970) 101-104. H. D. R. E. F.

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Last Updated: 04/30/2023

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Name: Duane Harber

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Job: Human Hospitality Planner

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Introduction: My name is Duane Harber, I am a modern, clever, handsome, fair, agreeable, inexpensive, beautiful person who loves writing and wants to share my knowledge and understanding with you.